A droplet containing 1 μl of a suspension of 3,0 μg μl "1 of Dynabeads® My One™ Streptavidin in 2x binding buffer was merged (supra) with the droplet containing the PCR mixture, mixed, and incubated at 65,0 C for 15 min.
Uma gotícula contendo 1 μl de uma suspensão de μg μl1 de Dybaneads® MyOneTM Streptavidina em 2x tampão de ligação foi combinada (supra) com a gotícula contendo a mistura PCR, misturada e incubada a 65 oC por 15 min.
5 mM imidazole, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-Cl, pH 7,9 for a sonication buffer; 5 mM imidazole, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-Cl, 8 M Urea, pH 7,9for binding buffer; 50 mM imidazole, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-Cl, 8 M Urea, pH 7,9 for a washing buffer; 4,0 mM imidazole, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-Cl, 8 M urea, pH 7,9 for an elution buffer.
After the resin was packed into the column, the resin was washed with a three to five column volume of distilled water, and the resin was charged with Ni2+using a five column volume of Ix charge buffer (50 mM NiSO4) and equilibrated with the binding buffer. thereby generating a Ni-chelate affinity column.
Após a resina ter sido empacotada na coluna, a resina foi lavada com um volume de água destilada de três a cinco colunas, e a resina foi carregada com Ni2+ usando um volume de cinco colunas de tampão de carga Ix (50 mM NiSO4) e equilibrada com o tampão de ligação, gerando assim uma coluna de afinidade de Ni-quelato.
After a sample was loaded onto the column twice, the column was washed with the binding buffer until the absorbance at 2,0 run reached a baseline of 1,0 and then with washing buffer for 10 min.
Após uma amostra ter sido carregada na coluna duas vezes, a coluna foi lavada com o tampão de ligação até absorbância a 2,0 nm ter atingido uma linha de base de 1,0 e então com tampão de lavagem por 10 min.
Concentrated fractions were dialyzed against a 30 mM Tris-HCl, pH 7,0, binding buffer and the purification of His-tagged proteins was performed on a Chelating Sepharose Fast Flow column (13,15 cm) (Amersham Biosciences) (38).
As frações concentradas foram dialisadas em um tampão de ligação de 30 mM de Tris-HCl, pH 7,0, e a purificação das proteínas marcadas com His foi realizada em uma coluna de Fluxo Rápido de Sefarose Quelante (13,15 cm) (Amersham Biosciences) (38).